1947年，Mandel和Metais首次報道了外周血中存在游離DNA（Cell-free DNA, cfDNA）。正常生理狀態(tài)下，血液中的cfDNA主要來源于白細(xì)胞的壞死和凋亡；在某些疾病和特殊狀態(tài)下，如組織損傷、癌癥和炎癥反應(yīng)等，細(xì)胞內(nèi)的DNA片段也會被釋放到各種體液中（血漿、腦脊液、尿液等）成為cfDNA。在癌癥早期，當(dāng)患者還未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀時，細(xì)胞內(nèi)DNA狀態(tài)就已經(jīng)發(fā)生變化，這些DNA被釋放到體液中，使得體液cfDNA中包含了與癌癥相關(guān)的重要信息。通過對這些信息進(jìn)行提取和處理，可對癌癥進(jìn)行非侵入式診斷，實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診療，因此，cfDNA檢測是目前市場上最常見的液體活檢形式。 髓母細(xì)胞瘤（Medulloblastoma，MB）是一種惡性的兒童胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有沿軟腦膜轉(zhuǎn)移的傾向。根據(jù)基因組特征可分為4個亞群：WNT、SHH、 Group 3和Group 4。手術(shù)切除結(jié)合放化療是目前治療MB的首選治療方案（可治療約70%的病人），術(shù)后的標(biāo)本則作為診斷和腫瘤特征分析的證據(jù)。MB能夠隨著時間的推移而發(fā)展，約1/3患有MB的兒童最終都是死于該疾病，存活下來的患者也需要長期忍受由于治療而產(chǎn)生的毒性。目前，除了磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）和腦脊液（Cerebrospinal fluid, CSF）細(xì)胞學(xué)檢測，還沒有可靠的分子生物標(biāo)志物來反應(yīng)MB的進(jìn)展情況。因此，通過縱向樣本開發(fā)強(qiáng)大的、微創(chuàng)的、臨床可操作的生物標(biāo)志物是非常必要的。 研究顯示，在 CNS 惡性腫瘤患者中，CSF來源的cfDNA比從血漿中分離出來的cfDNA具有更大的效用【1-2】。MB基因組幾乎沒有熱點(diǎn)驅(qū)動突變，而是以普遍的染色體拷貝數(shù)變異（Copy number variations, CNVs）為特征，因此限制了cfDNA 突變分析在MB中的通用性【2-3】。 近日，來自美國St. Jude兒童研究醫(yī)院的Paul A. Northcott團(tuán)隊在Cancer Cell雜志在線發(fā)表了題為Serial assessment of measurable residual disease in medulloblastoma liquid biopsies的文章。研究人員利用MB中染色體不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，通過低深度全基因組測序（Low-coverage whole-genome sequencing, Lc-WGS）對來自123名MB患者的476例CSF來源的cfDNA樣本進(jìn)行分析，鑒定了可作為可測量殘留病變（Measurable Residual Disease, MRD）標(biāo)志物的CNVs，闡釋了cfDNA檢測的疾病預(yù)測價值和診斷價值。 本研究共收集了來自123名MB患者的共476例CSF樣本，提取cfDNA進(jìn)行低深度全基因組測序（lcWGS），并進(jìn)行后續(xù)分析（圖1）。首先，作者評估了cfDNA來源的CNVs作為MRD標(biāo)志物的效用。數(shù)據(jù)顯示，在67例樣本（67/105）中檢測到了MRD；相反，7例非腫瘤CSF樣本中都沒有檢測到cfDNA來源的CNVs，即MRD陰性。MRD陽性CSF樣本與相應(yīng)的原發(fā)性腫瘤之間的CNVs檢測譜高度一致。MRD檢測與疾病的轉(zhuǎn)移狀態(tài)、分子亞群和腫瘤位置顯著相關(guān)，與年齡、性別、切除范圍、細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果以及切除和腦脊液取樣之間的時間無關(guān)。值得注意的是，無論相應(yīng)的腦脊液細(xì)胞學(xué)結(jié)果如何，MRD在高危疾病患者中的陽性率相似：91例腦脊液細(xì)胞學(xué)陰性的樣本中有56例樣本的MRD呈陽性。 圖1. 樣品收集及檢測流程圖 隨后，作者探究了連續(xù)MRD檢測與疾病復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。在30/77（39%）例放療后、21/75（28%）例化療中及20/68（34%）例治療結(jié)束的患者中檢測到MRD。出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)的患者在治療期間的MRD持續(xù)率明顯高于沒有復(fù)發(fā)的患者。在MRI顯示病情完全緩解的32例病人中，有16例病人在復(fù)發(fā)前3個月時就檢測到了MRD，此時影像學(xué)或細(xì)胞學(xué)異常還不能檢測到。在所有持續(xù)接受放化療或細(xì)胞學(xué)有差異的12例病人的CSF樣本（n=27）中均檢測到了MRD。24/25例患者在病情發(fā)展的3個月內(nèi)采集的腦脊液標(biāo)本中MRD呈陽性；在病情沒有進(jìn)展的患者中，193/209（92%）例CSF樣本都是MRD陰性。 那么，連續(xù)檢測MRD在臨床上有何價值？作者發(fā)現(xiàn)，那些放化療后、治療期間或已經(jīng)結(jié)束治療的病人中，MRD陽性病人的無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）比MRD陰性的病人差很多。與治療結(jié)束時MRI和腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查的標(biāo)準(zhǔn)評價進(jìn)行比較，同時進(jìn)行的MRD檢測對于病人分類更有效，其對殘留病變的靈敏度也更高（64% vs. 24%）。在治療結(jié)束的病人中，12/20（60%）MRD-陽性的病人的MRI/細(xì)胞學(xué)檢查正常，但后期其中的10位病人的病情都有所進(jìn)展；其余兩例病人MRI正常其MRD也呈陽性。在高風(fēng)險患者中，治療結(jié)束時的MRD與PFS有顯著關(guān)系。作為一個隨時間變化的變量，隨訪期間MRD檢測與PFS顯著相關(guān)。 接下來，作者對疾病復(fù)發(fā)中的腫瘤相關(guān)分子圖譜進(jìn)行了分析。為了同時在早期和疾病進(jìn)展期檢測漸進(jìn)性疾病（Progressive disease, PD）和MRD陽性患者的CSF，作者比較了從患者匹配的CSF樣本中提取的CNVs譜，發(fā)現(xiàn)了染色體非整倍性，提示12/15（80%）例患者存在克隆選擇或進(jìn)化。cfDNA 分析可以更早地檢測出那些在疾病復(fù)發(fā)時占主導(dǎo)地位的腫瘤克隆。在研究過程中，作者也注意到了原位腫瘤與cfDNA中檢測到的CNVs不一致的情況。例如，患者sj024被診斷為Group4髓母細(xì)胞瘤，隨后又出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性骨骼復(fù)發(fā)。然而與相應(yīng)的原位腫瘤CNV檢測結(jié)果相比，患者的cfDNA來源的CNVs譜更符合復(fù)發(fā)腫瘤特性，提示患者的CSF樣本中包含了具有侵略性的亞克隆，可以驅(qū)動疾病的進(jìn)展。 最后，作者進(jìn)一步評估了基于 lcWGS 的 cfDNA 分析在其他兒童腦腫瘤中的適用性。通過對17名非髓母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有患者在其相應(yīng)的原發(fā)腫瘤中都存在染色體和/或局灶性CNVs。基于lcWGS分析CSF來源cfDNA顯示，13例（76%）樣本呈MRD陽性，包括3例轉(zhuǎn)移樣本。此外，作者還觀察了與臨床過程相呼應(yīng)的cfDNA樣本的分子反應(yīng)，其與MB中的發(fā)現(xiàn)類似。 綜上所述，該研究利用從MB和其他CNS腫瘤患者收集的腦脊液樣本的大型縱向隊列，首次有效地、系統(tǒng)地論證了CSF來源的cfDNA譜在兒童CNS癌癥中檢測MRD的臨床效用（圖2）。雖然液體活檢的種類和方式非常豐富，但作者認(rèn)為使用lcWGS檢測CSF來源的cfDNA中的腫瘤相關(guān)CNVs非常適合于MB：（1）MB切除后患者腦脊液或血漿中cfDNA的含量明顯低于其他腦腫瘤患者【4-5】，這種低于毫微克的產(chǎn)物，若采用其他檢測方法（如表觀遺傳組和突變分析）是極具挑戰(zhàn)的，但對lcWGS已經(jīng)足夠；（2）染色體CNVs在兒童MB中幾乎無處不在，捕獲CNVs無需使用定制探針來靶向不同的突變驅(qū)動基因，適用于缺乏已知驅(qū)動基因突變的MB樣本。該研究支持將前瞻性cfDNA評估納入MB臨床試驗(yàn)，以進(jìn)行進(jìn)一步的研究和技術(shù)改進(jìn)，最終實(shí)現(xiàn)根據(jù)MRD反應(yīng)進(jìn)行個性化治療。
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